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minerva-biolabs常見問題與解答

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 Minerva-biolabs常見問題

蛋白酶K

提供多少毫克蛋白酶？

每小瓶蛋白酶K（目錄號(hào)56-0002）含有11 mg酶，約為30U/mg，再懸浮在550µl所含的再水合緩沖液中后，其濃度為20 mg/ml。

你推薦什么樣的培養(yǎng)條件？DNA提取試劑（Venor®GeM樣品制備試劑盒）建議添加蛋白酶K，然后繼續(xù)提取（10分鐘，70°C溫育）。這難道不會(huì)給酶足夠的時(shí)間來工作并可能降解它嗎？

在我們（廣泛）測(cè)試的方案中，蛋白酶K的孵育與樣品裂解同時(shí)進(jìn)行（您提到的步驟是在70°C下10分鐘）。其想法是將裂解和蛋白酶K處理結(jié)合在一個(gè)步驟中，從而使方案盡可能短而有效。我們的數(shù)據(jù)（和質(zhì)量控制）表明，這種處理對(duì)相對(duì)復(fù)雜的基質(zhì)非常有效，表明在短的培養(yǎng)時(shí)間（和酶過量！）下可以忽略變性。例如，對(duì)于更復(fù)雜的基質(zhì)如組織，我們建議分離提取/裂解步驟和蛋白酶K處理，并在酶的最佳溫度50-56°C下進(jìn)行蛋白酶K處理。。

我在用Venor®GeM樣品制備試劑盒分離支原體DNA時(shí)遇到問題。由于樣品的特殊性質(zhì)，有時(shí)會(huì)出現(xiàn)柱堵塞的問題。有時(shí)樣品中出現(xiàn)白色薄片（可能是有機(jī)來源），離心后留在上清液中，從而堵塞柱。

有時(shí)在含有較高蛋白質(zhì)量（例如疫苗、高血清濃度等）的樣品中觀察到柱堵塞。即使蛋白質(zhì)可能不是主要成分，它們也可能參與蛋白質(zhì)和其他成分之間復(fù)合物的形成。我們建議根據(jù)Venor®GeM樣品制備試劑盒手冊(cè)的說明嘗試蛋白酶K處理（70°C培養(yǎng)步驟之前的可選步驟）。

Venor®GeM樣品制備套件

我在用Venor®GeM樣品制備試劑盒分離支原體DNA時(shí)遇到問題。由于樣品的特殊性質(zhì)，有時(shí)會(huì)出現(xiàn)柱堵塞的問題。有時(shí)樣品中出現(xiàn)白色薄片（可能是有機(jī)來源），離心后留在上清液中，從而堵塞柱。

有時(shí)在含有較高蛋白質(zhì)量（例如疫苗、高血清濃度等）的樣品中觀察到柱堵塞。即使蛋白質(zhì)可能不是主要成分，它們也可能參與蛋白質(zhì)和其他成分之間復(fù)合物的形成。我們建議根據(jù)Venor®GeM樣品制備試劑盒手冊(cè)的說明嘗試蛋白酶K處理（70°C培養(yǎng)步驟之前的可選步驟）。

我們將對(duì)EP合規(guī)性進(jìn)行支原體檢測(cè)。因此，我們計(jì)劃使用Venor®GeM樣品制備試劑盒從細(xì)胞上清液中提取支原體DNA。然而，我們需要將一些上清液冷凍在-20oC。你建議什么：從所有樣本中提取DNA并冷凍它們，或者在95oC下處理上清液（穩(wěn)定步驟）并冷凍它們？我們能把它們冷凍多久？

我們強(qiáng)烈建議在取樣后直接加熱滅活樣品。如果你選擇冷凍，DNase在解凍階段會(huì)活躍，降解低拷貝數(shù)的支原體DNA。熱滅活后，您可以保存樣本，甚至可以在2-8°C的溫度下保存一周，并在室溫下無限制地處理它們。兩種版本都同樣有用：熱滅活或DNA提取，都是在采樣后立即進(jìn)行。

對(duì)于這兩個(gè)版本，您可以將樣品儲(chǔ)存在<-18°C的溫度下至少1年。

Venor®GeM產(chǎn)品線（用于常規(guī)PCR）

適用于所有Venor®GeM支原體檢測(cè)試劑盒

該試劑盒可檢測(cè)到多少種支原體？

基于引物基因組序列比對(duì)，我們的試劑盒可以檢測(cè)到至少110種屬于軟體動(dòng)物綱的物種（瘦子、支原體、螺旋體、支原體），其中約165種是文獻(xiàn)中提到的物種。然而，對(duì)于許多不太常見的物種，沒有可靠的數(shù)據(jù)或序列信息。因此，我們不能對(duì)這些物種的試劑盒特異性做出任何聲明。

重要的是，我們可以檢測(cè)出版物中提到的所有物種作為重要的細(xì)胞培養(yǎng)污染物和許多其他污染物。

適用于所有Venor®GeM支原體檢測(cè)試劑盒

內(nèi)部控制DNA（或內(nèi)部擴(kuò)增控制）的功能是什么？

內(nèi)部控制表示在同一PCR反應(yīng)管中與靶擴(kuò)增（支原體）平行發(fā)生的第二擴(kuò)增反應(yīng)。內(nèi)部控制擴(kuò)增子的出現(xiàn)表明條件是PCR允許的（沒有PCR抑制）。因此，內(nèi)部控制DNA是一種有用的驗(yàn)證工具，有助于排除假陰性。

在Venor®GeM試劑盒中，內(nèi)部控制與目標(biāo)擴(kuò)增反應(yīng)的競(jìng)爭(zhēng)較弱。結(jié)果，目標(biāo)DNA的強(qiáng)擴(kuò)增（例如強(qiáng)污染）可能導(dǎo)致內(nèi)部控制擴(kuò)增失敗。因此，在嚴(yán)重污染的樣本或非常有效的PCR擴(kuò)增的情況下，缺失內(nèi)部控制是全正常的情況。因此，內(nèi)部控制的結(jié)果與陽性PCR反應(yīng)無關(guān)。

適用于所有Venor®GeM支原體檢測(cè)試劑盒

我想在95°C下冷凍滅活步驟后的上清液，稍后再使用。在什么溫度下，我可以保存這些樣品多長(zhǎng)時(shí)間？

根據(jù)我們的經(jīng)驗(yàn)，樣品可以在-20°C下安全儲(chǔ)存至少1年。還可以將滅活上清液在RT下儲(chǔ)存5天或在+2-+8°C下儲(chǔ)存14天。

適用于所有Venor®GeM支原體檢測(cè)試劑盒

我們使用Venor®GeM qEP進(jìn)行的檢測(cè)一直效果良好。然而，這次陽性對(duì)照失敗了。補(bǔ)液后，試劑盒按照方案中的建議正確儲(chǔ)存。可能出了什么問題？您有哪些建議可以確保陽性對(duì)照的良好表現(xiàn)？

陽性對(duì)照作為一個(gè)小瓶提供。再水合后，只要您使用無DNase移液管端并在清潔的工作區(qū)域工作，該試劑在頻繁的解凍/冷凍循環(huán)中是穩(wěn)定的。

然而，等分補(bǔ)充水分的陽性對(duì)照可能會(huì)有所幫助。

我們建議將其等分到PCR管中，因?yàn)樗鼈兺ǔＪ歉蓛舻摹oDNase的和低結(jié)合性的。

適用于所有Venor®GeM支原體檢測(cè)試劑盒

在使用Venor®GeM支原體檢測(cè)試劑盒檢測(cè)支原體之前，請(qǐng)告訴我在沒有抗生素的情況下培養(yǎng)細(xì)胞48小時(shí)是否足夠？

如果您的抗生素沒有顯示出對(duì)支原體的活性，則可以在沒有任何事先無抗生素培養(yǎng)的情況下進(jìn)行測(cè)試，并將提供有關(guān)支原體污染的可靠信息。

在支原體活性抗生素的情況下，我們知道，在無抗生素培養(yǎng)的5天內(nèi)，大多數(shù)支原體種類的微小數(shù)量將增長(zhǎng)到易于檢測(cè)的水平。快速生長(zhǎng)的支原體種類可能在48小時(shí)后可被檢測(cè)到。總之，在沒有此類抗生素的情況下，等待5天培養(yǎng)物生長(zhǎng)將給您帶來可靠的結(jié)果。請(qǐng)記住，PCR是最敏感的方法。使用其他技術(shù)，您可能需要培養(yǎng)和延遲測(cè)試更長(zhǎng)時(shí)間。

適用于所有Venor®GeM支原體檢測(cè)試劑盒

Venor®GeM Classic手冊(cè)指出，在培養(yǎng)物中使用霉素和/或霉素不會(huì)影響測(cè)試。然而，我們使用的是抗生素抗真菌溶液，除了霉素和霉素外，還含有性霉素B。在進(jìn)行支原體測(cè)試之前，我們是否應(yīng)該在沒有抗生素抗真菌的情況下培養(yǎng)細(xì)胞？

性霉素B對(duì)支原體沒有活性，不應(yīng)影響支原體檢測(cè)。

補(bǔ)充抗生素抗真菌溶液的培養(yǎng)物可直接使用Venor®GeM Classic試劑盒進(jìn)行測(cè)試。

適用于所有Venor®GeM支原體檢測(cè)試劑盒

我們?cè)诿襟w上使用了大霉素，我想知道這是否會(huì)干擾測(cè)試。你指出霉素和霉素不會(huì)顯著改變測(cè)試的敏感性。大霉素會(huì)干擾嗎？

盡管PCR檢測(cè)本身不會(huì)受到大霉素的影響，但支原體在樣本中生長(zhǎng)的能力顯然會(huì)受到影響。大霉素對(duì)支原體有活性，不幸的是導(dǎo)致耐藥菌株的發(fā)展很快。因此，如果可能，我們通常建議在培養(yǎng)1周后，在沒有抗生素添加劑的情況下測(cè)試培養(yǎng)物。

適用于所有Venor®GeM支原體檢測(cè)試劑盒

我們希望在解凍后直接用Venor®GeM Advance測(cè)試細(xì)胞（在液氮中冷凍保存），而無需事先培養(yǎng)。這可能嗎？

用我們的PCR檢測(cè)方法（任何試劑盒）直接檢測(cè)解凍樣品或冷凍樣品通常是不可能的。原因是冷凍介質(zhì)中通常含有高濃度的FBS和DMSO。這兩種物質(zhì)都抑制PCR反應(yīng)。對(duì)于這樣的樣品，PCR前DNA提取是必要的。

僅適用于Venor®GeM Classic

我根據(jù)方案進(jìn)行的PCR沒有檢測(cè)到任何條帶（既沒有陽性對(duì)照，也沒有內(nèi)部DNA對(duì)照）。

試劑都是新鮮重懸的，沒有反復(fù)冷凍和解凍。我使用了熱啟動(dòng)Taq聚合酶，它在其他PCR反應(yīng)中表現(xiàn)良好。

出了什么問題？

•對(duì)于Venor®GeM Classic，我們建議使用熱啟動(dòng)DNA Taq聚合酶。

•使用在其他PCR設(shè)置中表現(xiàn)良好的聚合酶并不一定保證該特定PCR分析的成功。

•套件中提供的緩沖液對(duì)于底漆的正常工作至關(guān)重要。

•并非所有聚合酶在試劑盒緩沖液和條件下都表現(xiàn)良好。

•全沒有擴(kuò)增通常表明酶與試劑盒不兼容。

僅適用于Venor®GeM Classic、OneStep和Advance

一些樣本顯示出感興趣基因（支原體）的強(qiáng)條帶，而內(nèi)部對(duì)照沒有條帶。我的樣本是否被污染或PCR運(yùn)行無效？

只有陰性樣本才需要出現(xiàn)內(nèi)部控制帶。當(dāng)你的樣本被支原體嚴(yán)重污染時(shí)，它的DNA會(huì)被成比例地?cái)U(kuò)增。在這些條件下，由于試劑競(jìng)爭(zhēng)，內(nèi)部控制帶逐漸消失。因此，您可以得出結(jié)論，您的PCR運(yùn)行是有效的，不幸的是，您的樣本受到嚴(yán)重污染。

僅適用于Venor®GeM Classic、OneStep和Advance

如產(chǎn)品手冊(cè)所示，我們使用Venor®GeM Classic和Minerva Biolabs的Taq聚合酶。我們無法檢測(cè)到陽性或陰性控制通道中的任何頻帶（內(nèi)部控制未被放大）。原因可能是什么？

-在PCR反應(yīng)失敗的可能原因中，我們建議考慮使用中的PCR循環(huán)儀可能存在技術(shù)問題的可能性。這不是一個(gè)遙遠(yuǎn)的可能性。為了評(píng)估循環(huán)儀的性能，我們建議測(cè)試具有相同PCR設(shè)置的另一個(gè)循環(huán)儀或具有相同循環(huán)儀的另一PCR設(shè)置。

-陽性對(duì)照DNA的再水合不正確（例如體積）

-PC被正確地再水合，但進(jìn)行了太多的冷凍/解凍循環(huán)，或由于DNase污染而發(fā)生DNA降解。

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